Hội trường trong Cung điện Thánh. Ông nói rằng thành phố có bạo loạn. Một người không quen thuộc với anh ta ở đầu đám đông - người ướp xác, đeo mặt nạ, vũ công với chuông, người mặc áo choàng đen - đe dọa, dự đoán và kêu gọi mọi người không tuân theo nữ hoàng. Cận thần của Nữ hoàng Riccio xác nhận rằng thỉnh thoảng ông cũng theo dõi khi mọi người háo hức lắng nghe những bài giảng này. Trang này kể thêm rằng mọi người xông vào nhà nguyện của nữ hoàng la hét: Lũ giáo hoàng Giáo hoàng! Tổ ấm, đó là con trâu của Darnley, chồng của nữ hoàng, nhảy lên bàn thờ và bắt đầu giả vờ như một bài giảng, và mọi người trả lời anh ta bằng những câu thơ chế giễu. Nữ hoàng Mary Stuart trong tuyệt vọng. Cô cảm thấy sự căm thù của mọi người, hầu hết các cận thần đã rời bỏ cô; cô tự hỏi làm thế nào Kitô giáo của mình có thể khác với Kitô giáo của người Scotland. Riccio đề xuất ngay lập tức chuẩn bị một sắc lệnh trừng phạt những người chịu trách nhiệm về các cuộc bạo loạn. Maria ra lệnh cho trang của mình, trang này làm rõ có nên nhập tên của Heinrich Darnley - chồng của nữ hoàng hay không. Mary ngập ngừng; cô nghi ngờ rằng các cuộc bạo loạn được lấy cảm hứng từ anh ta - sau tất cả, đám đông được dẫn dắt bởi con trâu của nhà vua. Ở đây Riccio nhắc nhở cô rằng cô là nữ hoàng; Cô ấy giống như mặt trời, và cô ấy có quyền trừng phạt từ Chúa. Anh ta yêu cầu gọi ngay cho nhân viên nghĩa vụ để công bố sắc lệnh của Nữ hoàng. Douglas bước vào. Maria bảo anh ta mang tờ giấy cho Thủ tướng Hoàng gia Morton, để anh ta đóng dấu. Douglas quét sắc lệnh và thấy rằng nó không có tên của nhà vua. Ông hỏi nữ hoàng về điều này. Riccio chịu trách nhiệm cho cô ấy. Douglas đang mất bình tĩnh. Ông kêu gọi nữ hoàng không sử dụng các biện pháp đàn áp đẫm máu, gợi ý rằng ông coi đây là ảnh hưởng của Pháp hoặc Ý. Nhưng nữ hoàng lạnh lùng nhắc nhở anh về sức mạnh của mình để loại bỏ những đối tượng không vâng lời theo ý muốn của cô. Một cuộc cãi vã nổ ra giữa Riccio và Douglas, Douglas thách đấu với Riccio và thề rằng anh ta sẽ giết người Venice vào ngày mai. Nữ hoàng rời đi và đưa Riccio đi. Douglas bị bỏ lại một mình, anh ta đang xem xét một cuộc đấu tay đôi. Morton bước vào. Douglas chỉ cho anh ta nghị định. Morton thiếu quyết đoán: anh ta sợ sự phẫn nộ của cả nhà vua và hoàng hậu. Không dập, Morton trả giá cho nhà vua. Vào thời điểm này, Henry đang tham gia vào một cuộc trò chuyện với người bạn đời Nick, người đã trêu chọc anh ta rằng nữ hoàng có quyền lực thực sự ở Scotland, và Henry chỉ là chồng của cô, rằng nữ hoàng chọn những người thân thiết, ví dụ, người đàn hạc người Ý Riccio này ... Vào lúc này, Morton mang đến một nghị định không may. Vua giận dữ, anh quyết định giết Riccio. Vua Lindsay vào tòa án, ông gọi nhà vua đi săn cùng với chim ưng mới mua. Morton trả lời rằng nhà vua đã có một nghề nghiệp ngày hôm nay. Lindsay sẵn sàng tham gia âm mưu chống lại Riccio. Anh ta thực sự cấm giết Riccio tối nay, vì anh ta phải giết anh ta vào sáng mai. Sau đó, Henry, lợi dụng sự chậm trễ, gửi người hề đến nhà chiêm tinh để tìm hiểu vị trí của các ngôi sao là gì cho ý định của anh ta.

Nhà chiêm tinh trong phòng thí nghiệm của mình (ông cũng là một nhà giả kim) lập luận với chính mình rằng kinh nghiệm xác nhận sự vô ích của khoa học, mục đích đó, ý chí của các ngôi sao thống trị con người, loại bỏ thiện và ác. Nick bước vào, rắc rắc những lời dặn dò, nhà chiêm tinh không thua kém anh ta một cách dí dỏm. Nick báo cáo rằng nhà vua đã gửi cho anh ta để hỏi về số phận của Riccio và nói với nhà chiêm tinh dự đoán cái chết của Riccio. Nhà chiêm tinh trả lời rằng các ngôi sao sẽ nói với anh ta, không phải người, và lần lượt dự đoán cái chết của người hề. Nói xong anh bỏ đi. Trang của nữ hoàng gây ra bởi nhà chiêm tinh xuất hiện. Trang yêu nhân tình của mình. Nhà chiêm tinh bảo anh ta nói với nữ hoàng rằng hôm nay người đàn ông cô yêu sẽ chết. Làm thế nào, Botwell sẽ chết ngày hôm nay? - kêu lên một trang. Nhà chiêm tinh hoang mang. Anh ấy đã nghĩ đến Riccio và đang vội vã trang để cảnh báo anh ấy về điều này. Còn lại một mình, nhà chiêm tinh tự hỏi - nó cũng xuất hiện từ những ngôi sao mà Botwell bằng cách nào đó có mối liên hệ đen tối với nữ hoàng - thông qua Sao Hỏa, Sao Thổ ... Botwell bước vào. Từ lời độc thoại của anh ta, nó trở nên rõ ràng rằng anh ta bất ngờ thấy mình trong nhà của một nhà chiêm tinh. Nhận ra nơi anh ta có được, Botwell hỏi nhà chiêm tinh rằng anh ta còn lại bao nhiêu để sống. Ông già trả lời rằng ba năm nữa và Botwell sẽ trở thành vua. Botwell lấy ra một chai thuốc độc mà anh ta muốn tự tử, muốn vứt nó đi - và do dự. Thật vậy, trong bầu không khí của những mưu đồ trong cung điện, bất kỳ vũ khí nào cũng sẽ có ích. Anh ấy đang bỏ đi.

Trang nói với nữ hoàng rằng Riccio sẽ đến sớm. Nữ hoàng đang mong chờ anh - theo ý kiến ​​của cô, một mình anh vẫn trung thành với cô. Mùi và Botvel? Trang hỏi. Botvel là ai? - nữ hoàng quan tâm. Một trang ngạc nhiên cho Mary biết, trong khi chèo thuyền, một cơn gió mạnh đã nhổ một bông hồng từ đầu nữ hoàng, một bông hoa rơi xuống nước. Và sau đó, một trong những cận thần - Botvel - đã lao vào thuyền và sợ hãi đuổi theo người chèo thuyền để bắt một bông hồng từ mặt nước. Sau khi nghe câu chuyện, Mary gửi một trang để cầu nguyện. Cô thú nhận với Chúa rằng cô không còn sức mạnh để cưỡng lại tình yêu của mình dành cho Botwell. Nữ hoàng biết rằng tại tòa án, cô được coi là yêu Riccio. Riccio bước vào. Mary báo cáo một mối nguy hiểm chết người đe dọa anh ta và lạnh lùng nói lời tạm biệt với anh ta, chỉ anh ta vào con tàu sẽ đưa anh ta đến Rome. Trong tuyệt vọng, Riccio cố gắng cầu xin nữ hoàng hủy bỏ quyết định ra đi. Nữ hoàng kiên quyết.

Heinrich, Morton và Lindsay đã biết về sự ra đi sắp xảy ra của Riccio và vội vàng quyết định giết anh ta hoặc để anh ta đi thuyền. Sau đó Douglas xuất hiện và báo cáo rằng Riccio đã đi thuyền. Douglas trong tuyệt vọng, anh khao khát được trả thù đẫm máu, danh dự hiệp sĩ của anh bị tổn thương. Đột nhiên họ gặp một trang mang đến cho nữ hoàng một lời nhắn từ Riccio - anh ta đã không rời đi và sẽ ở bên cô ấy vào buổi tối. Những kẻ âm mưu lấy đi nốt nhạc.

Maria đang bận thêu thùa trong phòng. Riccio, người đến, giải thích với cô rằng anh không thể rời đi, vì anh đã đấu với Douglas vào buổi sáng. Anh thừa nhận rằng anh không cần cuộc sống mà không có tình yêu của cô. Anh ta yêu cầu Mary tặng cho anh ta một vòng hoa hồng - anh ta sẽ trồng hoa trên bàn thờ ở Rome ... Henry, Douglas và Dindsay đến và giết Riccio. Nữ hoàng ngất xỉu. Douglas bị tấn công bởi sự xấu hổ và kinh hoàng - anh ta tự nguyện rút lui đi lưu vong. Henry lo lắng nếu nữ hoàng sẽ ghét anh ta. Lindsay đưa nhà vua đi, thì thầm với anh ta về cuộc săn lùng sắp tới. Nữ hoàng Botwell được Nữ hoàng mời. Mary tỉnh táo, nhìn thấy Botvel và thú nhận tình yêu của anh với anh. Botvel buộc cô phải thừa nhận rằng cô muốn cái chết của Henry và đưa cho cô chai thuốc độc, nói rằng đây là thuốc ngủ. Mary đưa cho nhà vua "thuốc" này, nhưng chất độc uống nước trâu. Tuy nhiên, không gì có thể ngăn chặn âm mưu giết người - Botwell làm nổ tung ngôi nhà của Vua Henry. Từ xa, tiếng khóc ngày càng lớn của đám đông được nghe thấy. Botvel với nữ hoàng đang trốn.